當(dāng)我們歷經(jīng)種種挑戰(zhàn)獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)常會(huì)發(fā)出疑問(wèn)三連：

• 我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不是準(zhǔn)確？
• 我的結(jié)果是否出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性？
• 結(jié)果的差異是不是因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)中的變量造成的？

要回答這些問(wèn)題，合適的對(duì)照樣品就成了不可或缺的一環(huán)。

一、陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照

• Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有雜帶？
• IHC 實(shí)驗(yàn)沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)？
• 目的蛋白表達(dá)定位與文獻(xiàn)報(bào)道的有出入怎么辦？

要回答這些問(wèn)題，就需要在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰性或陽(yáng)性對(duì)照。

陽(yáng)性對(duì)照品一般會(huì)使用文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的高表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照確保了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，也保證了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中抗原抗體的結(jié)合效率。

陰性對(duì)照品一般會(huì)使用或文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的低表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)胞，使用敲低或敲除目的基因的樣本。在 IHC/ICC 實(shí)驗(yàn)中，也可以用 PBS 或同型對(duì)照代替一抗。陰性對(duì)照確保了實(shí)驗(yàn)的特異性，排除非特異性信號(hào)對(duì)結(jié)果造成的干擾。

接下來(lái)，我們舉個(gè)例子：

比如用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，常常用 Alpha-SMA 作為肝纖維化的標(biāo)志物。在進(jìn)行 IHC 實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了保證陽(yáng)性信號(hào)的可靠性，就需要平行加一個(gè)胃或結(jié)腸組織的樣本作為對(duì)照。因?yàn)?，Alpha-SMA 會(huì)特異性的表達(dá)在平滑肌細(xì)胞，而黏膜細(xì)胞無(wú)表達(dá)。

圖片來(lái)源：W Li et al. Cell Death Dis (2019).

如上圖的所示，胃平滑肌層陽(yáng)性信號(hào)明顯，黏膜層無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，證明抗體得到的信號(hào)是敏感且特異的（Alpha-SMA，貨號(hào) NBP2-33006）。

二、同型對(duì)照

這個(gè)概念，相信深諳流式細(xì)胞技術(shù)的小伙伴都耳熟能詳。因?yàn)榭贵w本身的特殊功能，特別是抗體 IgG Fc 段與細(xì)胞的 Fc 受體結(jié)合的能力，會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的非特異性信號(hào)加強(qiáng)。

同時(shí)，在一些抗體的功能性實(shí)驗(yàn)，比如中和實(shí)驗(yàn)和封閉實(shí)驗(yàn)中，也會(huì)對(duì)細(xì)胞（尤其是免疫細(xì)胞）的生理功能產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期或文獻(xiàn)報(bào)道不相符。

抗體結(jié)構(gòu)與抗體類(lèi)型示意圖

這時(shí)，同型對(duì)照就是必不可少的工具：

同型對(duì)照是陰性對(duì)照的一種，是利用與實(shí)驗(yàn)抗體同亞型的免疫球蛋白，排除實(shí)驗(yàn)本底信號(hào)的工具。廣泛運(yùn)用在免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、抗體封閉中和實(shí)驗(yàn)等一些以抗原-抗體結(jié)合為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)中。

同型對(duì)照需要選用與目標(biāo)抗體相同種屬來(lái)源、相同的免疫球蛋白類(lèi)型及亞型的抗體。如果是應(yīng)用在流式細(xì)胞術(shù)，還需要標(biāo)記相同的熒光素。我們通常建議選用來(lái)自與特異熒光抗體相同生產(chǎn)廠家的同型對(duì)照抗體, 因?yàn)槠渖a(chǎn)工藝、熒光蛋白比值以及標(biāo)記工藝都是相同的。

比如：

用  Mouse Anti-Human MICA PE-conjugated Monoclonal Antibody（貨號(hào) FAB1300P）檢測(cè) K562  細(xì)胞表面的 MICA，因?yàn)樵摽贵w的種屬來(lái)源是小鼠，免疫球蛋白是 IgG，亞型是 2B，標(biāo)記的熒光素是 PE，所以，我們使用的同型對(duì)照應(yīng)該是 Mouse IgG2B PE 抗體（貨號(hào) IC0041P）。

如上圖，左邊藍(lán)色的峰為同型對(duì)照，右邊橙色的峰為 MICA 特異性的 PE 信號(hào)峰。有了同型對(duì)照，自然就能分辨出合適的陽(yáng)性熒光強(qiáng)度，為之后設(shè)門(mén)和進(jìn)一步分析打下可靠的基礎(chǔ)。

設(shè)置合適的對(duì)照就像給實(shí)驗(yàn)加上一層保險(xiǎn)，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化及 trouble shooting 提供了重要的線索。

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