大家好，我是小菜雞張三，萬萬沒想到師兄讓我寄幾獨(dú)立做 ELISA 了。這個(gè)我懂，平時(shí)跟著師兄勤學(xué)苦練，拍板加樣我是有模有樣。

待我左手一個(gè) OD450 nm，右手一個(gè) 540，納尼？化學(xué)發(fā)光法 ELISA 說明書上怎么沒有 OD 值的要求?。俊干倌昀?，不是所有的 ELISA 都要測 OD 值喲?！拱抵杏^察已久的師兄得意揚(yáng)揚(yáng)地飄過。

下面是小博士上課時(shí)間

什么是化學(xué)發(fā)光法 ELISA？

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。首先將酶直接標(biāo)記在抗原或抗體上，再經(jīng)過抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體免疫復(fù)合物。通過不同底物與酶反應(yīng)后產(chǎn)生的特定產(chǎn)物的特性，達(dá)到定量檢測特定分子的目的。根據(jù)底物及相應(yīng)產(chǎn)物的不同，ELISA 可分為比色法（Colorimetric）與化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescent）兩類。

化學(xué)發(fā)光法酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)（Chemiluminescent ELISA）是在免疫反應(yīng)結(jié)束后，加入酶的發(fā)光底物，產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的中間體。之后中間體會(huì)發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài)，此發(fā)光強(qiáng)度可由光度計(jì)（Luminometer）進(jìn)行檢測，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測物的含量。相比于比色法，化學(xué)發(fā)光法具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍。

常見的化學(xué)發(fā)光組合是魯米諾（3-aminophthal hydrazide, Luminol）底物與辣根過氧化物酶反應(yīng)。魯米諾于 1928 年首次被合成為化學(xué)發(fā)光底物，該底物的發(fā)光反應(yīng)需要苛刻的條件，發(fā)光暗淡且持續(xù)時(shí)間短。

之后研究人員發(fā)現(xiàn)，加入增強(qiáng)劑的增強(qiáng)型魯米諾反應(yīng)（圖 1）能夠長時(shí)間產(chǎn)生明亮且穩(wěn)定的發(fā)光效果，從而使得其廣泛應(yīng)用于免疫分析，目前 R&D Systems? 的 QuantiGlo? 系列及 Novus Biologicals? 的 Chemiluminescent ELISA 均采用此原理。

圖 1：增強(qiáng) luminol/peroxide 底物用于化學(xué)發(fā)光檢測

QuantiGlo? ELISA Kit 的基本檢測步驟

第一步：向包被有捕獲抗體的微孔板中加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，孵育使分析物與包被的抗體結(jié)合，將未結(jié)合的其他分子清洗掉。

第二步：加入 HRP 偶聯(lián)的抗體（檢測抗體）并與一抗捕獲的分析物結(jié)合。未結(jié)合的檢測抗體被沖洗掉。

第三步：加入增強(qiáng)的魯米諾底物，使之與 HRP 反應(yīng)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與樣品中存在的分析物數(shù)量成正比。利用微孔板光度計(jì)測量發(fā)光強(qiáng)度。

QuantiGlo? 試劑盒檢測參數(shù)設(shè)置及應(yīng)用舉例

如 QuantiGlo? 試劑盒說明書所列，光度計(jì)設(shè)定可以使用以下參數(shù)或同等參數(shù)：1.0 分鐘滯后時(shí)間、檢測時(shí)間 0.5 秒/孔、求和模式、自動(dòng)增益或同等。

需要注意的是：

相對(duì)光單位（Relative light units，RLUs）數(shù)值由不同光度計(jì)檢測可能不同，需要按照儀器制造商的建議調(diào)整設(shè)置。

相對(duì)光單位的數(shù)值可能在 15 分鐘的閱讀窗口期間內(nèi)發(fā)生變化，由于需要參考標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值換算，所以這并不會(huì)影響結(jié)果。

應(yīng)用舉例 1：Human VEGF QuantiGlo ELISA Kit（貨號(hào) QVE00B）

使用 MOLECULAR DEVICE 品牌的 SpectraMax? L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測（SpectraMax? M5/M5e 和 FlexStation? 3 多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光檢測模式也適用）。數(shù)據(jù)的收集和計(jì)算推薦由 SoftMax? Pro 軟件完成，其預(yù)設(shè)的模板極大地簡化了相應(yīng)流程。

實(shí)驗(yàn)步驟及儀器參數(shù)設(shè)置：

1. 每孔加入 150 μL 實(shí)驗(yàn)稀釋液 RD1-8；

2. 在微孔板中按 3 復(fù)孔形式加入 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或空白對(duì)照（Calibrator 稀釋液）。室溫輕度振蕩（推薦  500 ± 50 rpm）微孔板 2 小時(shí)；

3. 孵育結(jié)束后使用排槍吸干孔內(nèi)反應(yīng)液，并用 400 μL 洗滌液清洗 4 遍。最后吸干剩余洗滌液并在干凈的吸水紙上拍干；

4. 每孔加入 200 μL VEGF 復(fù)合物，貼上新的粘合帶。室溫輕度振蕩 (推薦 500± 50 rpm) 微孔板 3 小時(shí)；

5. 按照步驟 3 進(jìn)行清洗步驟；

6. 每孔加入 100 μL Glo 工作液，室溫避光孵育 5 至 20 分鐘；

7. 用 SpectraMax? L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測定 RLU 值。相關(guān)參數(shù)如下：1 秒檢測時(shí)間，PMT 自動(dòng)和 470 nm 目標(biāo)校準(zhǔn)波長。

結(jié)果：顯示由 SpectraMax? L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀按照上述的參數(shù)所得的 VEGF 標(biāo)準(zhǔn)曲線, 其動(dòng)態(tài)范圍超過 4 個(gè)數(shù)量級(jí)，計(jì)算所得的檢測限，也就是空白對(duì)照信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差 3 倍值的相應(yīng)量為 1.5 pg/mL，與該試劑盒平均檢測下限為 3.3 pg/mL 相符。

圖 2，20,000-1.3 pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品檢測曲線圖。實(shí)驗(yàn)由 SpectraMax? L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀按照 1 秒檢測時(shí)間，PMT 自動(dòng)和 470 nm 目標(biāo)校準(zhǔn)波長的參數(shù)進(jìn)行讀取。標(biāo)準(zhǔn)曲線由 SoftMax? Pro 軟件繪制。

應(yīng)用舉例 2：Human IL-6 QuantiGlo ELISA Kit（貨號(hào) Q6000） 

使用 DYNEX TECHNOLOGIES 品牌的 MLX? 微量滴定光度計(jì)測量光的強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分析結(jié)果。由于底物發(fā)光持續(xù)時(shí)間長，所以閱讀窗口期可以是加入底物后的 20~40 分鐘之間。實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

儀器參數(shù)設(shè)定：

① 起始模式（Start Mode）：1 分鐘滯后時(shí)間

② 振蕩及溫度設(shè)定：關(guān)閉（Off）

③ 檢測選項(xiàng)：

• 自動(dòng)讀取 (Auto Gain)
• 求和模式 (Sum all Readings)
• 檢測時(shí)間 1 秒/孔

軟件操作：

① 只含有校準(zhǔn)稀釋液（Calibrator Diluent）的標(biāo)準(zhǔn)品零值孔被定義為空白孔（Blank）：
含有其他不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的孔被定義為 S1-S5 孔。
含有陽性對(duì)照（Control）的孔根據(jù)對(duì)應(yīng)標(biāo)簽使用「用戶可定義的類型（User Definable Types）」定義為 LL、L、M、H。
含有樣本的孔需定義為測試品（Tests）。

② 在空白模式窗口中，選擇平均（Average）。將所有空白孔（標(biāo)準(zhǔn)品零值孔）取平均值，其他孔值將統(tǒng)一減去這個(gè)平均值。

③ 在曲線擬合（curve fit）窗口中，輸入 S1-S5 的 IL-6 標(biāo)準(zhǔn)品濃度，并在相對(duì)光（Relative Light）窗口使用 log/log Cubic Spline 模式擬合并繪制曲線。

④ 數(shù)據(jù)矩陣（Data Matrix）及擬合曲線圖將呈現(xiàn)在測試報(bào)告（Test Report）中。

結(jié)果：

——「喔，我明白了，師兄選這個(gè)盒子是考慮到實(shí)驗(yàn)組間樣本中目標(biāo)分析物的含量差異大，過多的稀釋操作一方面費(fèi)時(shí)費(fèi)力，另一方面容易造成誤差對(duì)吧，師兄果然厲害！」

——「其實(shí)，主要還是因?yàn)槲覒小?/p>

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