據(jù)報(bào)道，目前每年都會(huì)有20%的人感染流感病毒，接種流感疫苗是抵御病毒的有效防范措施。

傳統(tǒng)的流感疫苗采用將流感病毒株接種到雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液，病毒滅活、純化等步驟制成。這種工藝路線成本相對(duì)較高，而且污染微生物的風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)接種者有可能引起過敏反應(yīng)。因而，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)疫苗是另外一種選擇，有利于迅速實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

2012年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)Flucelvax作為第一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞（MDCK）生產(chǎn)的美國(guó)流感疫苗。

對(duì)于疫苗生產(chǎn)來說，如何優(yōu)化工藝，最大程度的提高產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，一直是永恒的話題。除了優(yōu)化下游的步驟，是否有可能從上游細(xì)胞入手，通過改變關(guān)鍵基因獲得產(chǎn)病毒能力更高的MDCK細(xì)胞株？

ATCC把目標(biāo)鎖定在了STAT1基因。

STAT1蛋白是細(xì)胞干擾素抗病毒應(yīng)答的重要分子。ATCC通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功敲除MDCK STAT1基因，開發(fā)了一個(gè)新的細(xì)胞模型MDCK.STAT1KO (ATCC? CCL-34-VHG)。

實(shí)驗(yàn)證明基因編輯后的細(xì)胞沒有STAT1蛋白表達(dá)，與親本細(xì)胞系相比，病毒產(chǎn)生能力明顯增加，接種甲型流感（H1N1；ATCC?VR-1736?)后，病毒滴度提高了30倍。

圖1. 甲型流感（H1N1；ATCC?VR-1736?) 接種 STAT1-KO-MDCK 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（A）MDCK WT 親本和 MDCK.STAT1 型 KO 細(xì)胞，接種甲型流感，48小時(shí)后收集細(xì)胞上清液。綠色-抗流感病毒染色，藍(lán)色-核染色。（B）感染甲型流感病毒48小時(shí)后細(xì)胞上清液的TCID50值。（C） RT-PCR法定量檢測(cè)感染48小時(shí)后甲型流感病毒基因組拷貝數(shù)。

圖2. STAT1-KO-MDCK 細(xì)胞特征。（A）MDCK.STAT1KO 細(xì)胞 STAT1 基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)STAT1基因斷裂。（B）測(cè)序結(jié)果顯示，MDCK.STAT1KO 細(xì)胞是一個(gè)雜合子。一條等位基因存在單一堿基插入，另一個(gè)等位基因存在4堿基的缺失。（C）WB結(jié)果顯示，無論是低代次還是高代次， MDCK.STAT1KO 細(xì)胞都沒有 STAT1  蛋白表達(dá)。

圖3. STAT1-KO-MDCK 細(xì)胞無 Cas9/CMV 基因序列的整合。

圖4. STAT1-KO-MDCK 細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的非靶向突變。

改良后的MDCK細(xì)胞（MDCK.STAT1KO (ATCC? CCL-34-VHG)）大大提高了病毒生產(chǎn)滴度，穩(wěn)定的STAT1敲除基因型，無Cas9/CMV 基因序列的整合，無脫靶導(dǎo)致的突變。以上特征使得該細(xì)胞成為基礎(chǔ)研究、病毒疫苗生產(chǎn)的一個(gè)優(yōu)質(zhì)細(xì)胞模型。